ДИАГНОСТИКА В МЕДИЦИНЕ

УДК 616-002.5-078

© Коллектив авторов, 2010

Поступила 02.09.2009 г.

Т. Р. ВОЗЯКОВА, О. Е. СТЕБЛОВСКАЯ,

В. Н. МАКСИМОВА, Ж. В. ЕЛЕНКИНА,

Л. В. АФАНАСЬЕВА

МЕТОД УСКОРЕННОЙ ДИАГНОСТИКИ ТУБЕРКУЛЕЗА

Республиканский противотуберкулезный диспансер,

Чувашский государственный университет имени И. Н. Ульянова, Чебоксары

Представлены результаты сравнения диагностических возможностей автоматизированной системы BACTEC MGIT 960 с использованием жидкой питательной среды для выделения МБТ и определения лекарственной чувствительности МБТ к противотуберкулезным препаратам с традиционными методами культуральный диагностики на плотных питательных средах Левенштейна — Йенсена. Автоматизированная система ВАСТЕС MGIT 960 сокращает сроки выделения МБТ из диагностического материала в среднем до 10-20 дней, уменьшает длительность определения лекарственной чувствительности МБТ до 6-15 дней с момента выделения культуры и имеет специальный набор реактивов для тестирования чувствительности МБТ к пиразинамиду.

These are the comparison results of diagnostic possibilities of automated system BACTEC MGIT 960 using liquid TB medium and detection of MTB susсeptibility to TB drugs and traditional methods of cultural diagnostics with solid medium ????? Automated system BACTEC MGIT 960 reduces the terms of MTB growth up to 10-20 days in average and the terms of detection of MTB susсeptibility to TB drugs up to 6-15 days from the date of culture detection. There is a special range of reagents for MTB susceptibility topyrazinamid.

Введение. На фоне напряженной эпидемической ситуации с заболеваемостью туберкулезом и наличия лекарственно-устойчивых форм M. Tuberculosis наиболее актуальными являются ускоренная диагностика туберкулеза и повышение эффективности определения лекарственной чувствительности культур микобактерий туберкулеза (МБТ) к противотуберкулезным препаратам. Выявление МБТ в разном патологическом материале от пациентов − ведущий признак для постановки диагноза заболевания туберкулезной этиологии. Определение лекарственной чувствительности МБТ чрезвычайно важно для характеристики эпидемиологической ситуации, прогнозирования течения туберкулезного процесса у конкретного больного, выбора рациональной схемы противотуберкулезной терапии и правильной оценки эффективности лечения. Самым надежным методом выявления возбудителя туберкулеза в мокроте или в других образцах является метод посева, который позволяет выявить МБТ при наличии в исследуемом материале нескольких сотен жизнеспособных особей [12]. Первостепенной потребностью фтизиатров является сокращение времени получения результатов культурального исследования. Методом посева на плотную питательную среду Левенштейна − Йенсена (ЛЙ), являющимся «золотым стандартом» детекции микобактерий в практических лабораториях, видимый рост МБТ можно получить в лучшем случае на 28 — 32 день с момента посева, а средними сроками для выделения культуры являются 6 — 10 недель. С момента выделения культуры требуется ещё не менее 24 дней для определения лекарственной чувствительности МБТ методом абсолютных концентраций.

Длительные сроки получения результатов, обусловленные медленным ростом микобактериальной популяции, являются основным недостатком традиционных методов определения лекарственной чувствительности МБТ. На практике это означает, что химиотерапия больного туберкулезом в течение первых 2 — 3 месяцев проходит как бы «вслепую», без учета чувствительности выделенных у больного МБТ к противотуберкулезным препаратам. На плотных средах ЛЙ методом абсолютных концентраций тестирование на лекарственную чувствительность МБТ занимает от 45 до 90 дней с момента посева, что удлиняет сроки лечения больного и увеличивает стоимость [1, 5].

Принципиально новый уровень бактериологической диагностики туберкулеза достигнут внедрением в практику автоматизированных систем бульонного культивирования для ускоренного выявления микобактерий BACTEC MGIT 960 («Becton Dickinson») и MB/BacT («Organon Teknika»), позволяющих выявлять рост культуры в диагностическом материале в течение 10 — 20 дней [7; 4].

Автоматизированная система BACTEC MGIT 960 зарекомендовала себя надежным методом микробиологической диагностики туберкулеза как в мире, так и во многих регионах России [1, 2, 4, 5, 7, 10, 11, 13]. Эталонные исследования эффективности использования автоматизированных систем культивирования на жидких питательных средах BACTEC MGIT 960 и их преимуществ по сравнению с традиционным методом посева на плотные среды проведены в Московском городском научно — практическом Центре борьбы с туберкулезом под руководством доктора медицинских наук В. И. Литвинова [4, 7].

По данным авторов, чувствительность автоматизированной системы ВАСТЕС MGIT 960 по выделению культур МБТ оказалась на 10% выше традиционного способа посева на среду ЛЙ. Система BACTEC MGIT 960 продемонстрировала также более высокую высеваемость МБТ из бактериоскопически негативного материала, примерно на 15%, по сравнению с плотными средами. Для бактериоскопически позитивного материала чувствительность жидких и плотных сред для культивирования оказалась идентичной [4].

По данным зарубежных исследователей, в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960 удалось получить примерно на 2,2 — 4% больше изолятов МБТ из образцов мокроты, чем на плотной среде ЛЙ [10, 13]. Внедрение в практику бактериологических систем типа BACTEC MGIT 960 позволило сократить сроки выделения культуры МБТ. В среднем период культивирования образца на ВАСТЕС MGIT 960 составил 11 — 15, на плотной среде — 20 — 28 дней [2, 8, 13].

Автоматизированная система BACTEC MGIT 960 позволила за относительно короткий период времени — в среднем за 2 недели − исследовать выделенные культуры микобактерий туберкулеза на чувствительность к противотуберкулезным препаратам (ПТП) первого ряда, в том числе к пиразинамиду [5, 7, 8]. Традиционным для определения лекарственной чувствительности (ЛЧ) к основным ПТП в России являлся метод абсолютных концентраций на плотной среде ЛЙ [9]. Система BACTEC MGIT-960 показывала значительное совпадение результатов тестирования чувствительности МБТ к антибактериальным препаратам с результатами, полученными методом абсолютных концентраций. Для рифампицина и изониазида совпадение данных о наличии чувствительных или резистентных форм МБТ составило 98,5 и 98,25% соответственно, для стрептомицина — 97,26, для этамбутола — 93,77%. При этом сроки получения результатов теста ЛЧ в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960 составили от 4 до 13, тогда как по методу абсолютных концентраций — от 21 до 26 суток, что очень важно для своевременного и правильного выбора схемы противотуберкулезной терапии [4, 6].

Цель исследования: сравнить диагностические возможности автоматизированной системы BACTEC MGIT 960 по выделению МБТ и определению лекарственной чувствительности МБТ к ПТП с традиционными методами культуральный диагностики на плотных питательных средах ЛЙ, на основе данных, полученных в микробиологической лаборатории Республиканского противотуберкулезного диспансера в 2008 году и первом полугодии 2009 года.

Материалы и методы.В 2007 году микробиологическая лаборатория Республиканского противотуберкулезного диспансера в соответствии с проектом Международного банка реконструкции и развития была оснащена автоматизированной системой для экспресс — диагностики МБТ BACTEC MGIT 960 («Becton Dickinson», США). Прибор BACTEC MGIT 960 состоит из трех секций, вмещающих 960 пробирок, это позволяет исследовать в течение года примерно 8 тыс. образцов диагностического материала. Прибор весит 351 кг и имеет небольшие габариты (92X135X85 см).

Возбудитель в автоматизированной системе BACTEC MGIT 960 выделяется на основе постоянного компьютерного мониторинга состояния бактериальной популяции. Основным компонентом системы является пробирка MGIT (Mycobacterial Growth Indicator Tube) с флюоресцентным индикатором роста, который находится под силиконом на дне пробирки и погашается высокими концентрациями кислорода, растворенного в среде. В системе используется обогащенная жидкая питательная среда Middlebrook 7H9. Размножающаяся микробная популяция активно поглощает кислород, высвобождая флюоресцентный компонент, который начинает светиться при ультрафиолетовом облучении. Технология MGIT предполагает периодическое (1 раз в час) ультрафиолетовое тестирование индикаторных пробирок с диагностическим материалом при помощи встроенного компьютера. На жидкокристаллическом дисплее в каждой секции специальные индикаторы высвечивают информацию о наличии положительных и отрицательных посевов. Прибор BACTEC MGIT 960 оценивает пробирку как позитивную, если количество живых микробов ней достигло 100 тыс. на 1 мл среды.

Для подтверждения роста микобактерий в «позитивной» пробирке используют мазок из выросшей культуры с окраской по Цилю — Нильсону для выявления кислотоустойчивых микобактерий (КУМ). Дополнительно для исключения контаминации мазки из «позитивных» пробирок окрашивают по Граму и применяют пересев содержимого на чашки с кровяным агаром.

В системе BACTEC MGIT 960 для определения лекарственной чувствительности культур МБТ к ПТП используется набор индикаторных пробирок, содержащих препараты, которые крепятся на специальном носителе со штрих-кодом для непрерывного мониторинга скорости размножения культуры. Прибор оценивает рост микробной популяции, фиксируя его в специальных единицах роста GU (Grownth Unit), и определяет её статус: R (Resistant) — устойчивый и S (Susceptible) — чувствительный.

Лекарственная чувствительность в системе BACTEC MGIT 960 определяется как к низким, так и к высоким концентрациям основных ПТП: изониазид (INH), рифампицин (RIF), этамбутол (EMB) и стрептомицин (STR). Благодаря использованию в системе модифицированного бульона Middlebrook 7H9, который поддерживает рост МБТ при сниженной до 5,9 рН, система BACTEC MGIT 960 позволяет получить данные о чувствительности к пиразинамиду, который также является препаратом первого ряда, но не доступен для тестирования на плотных средах.

Для оценки диагностических возможностей автоматизированной системы BACTEC MGIT 960 исследовано 3310 клинических образцов на наличие МБТ, полученных из мокроты, промывных вод бронхов, плевральной жидкости больных, проходивших обследование и лечение в Республиканском противотуберкулезном диспансере в 2008 году и первом полугодии 2009 года.

Метод абсолютных концентраций на плотной среде ЛЙ для определения ЛЧ M. Тuberculosis использовали в соответствии с приказом Минздрава России №109 от 21.03.2003 [5].

Результаты и обсуждение.За указанный период из исследованных клинических образцов всеми методами получено 1313 культур МБТ, причем 94% выделены в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960, 76% показали рост на плотной среде ЛЙ (табл. 1).

Таблица 1

Результативность системы ВАСТЕС MGIT 960 и плотных сред

Левенштейна — Йенсена по выделению культур МБТ

Таким образом, ложноотрицательные результаты по выделению культуры МБТ в системе ВАСТЕС MGIT 960 имели место в 6% случаев, что в 4 раза меньше, чем классическим методом на среде ЛЙ, в которой данный показатель составил 24%. В результате сравнения данных культивирования чувствительность системы ВАСТЕС MGIT 960 оказалась в среднем на 18% достоверно выше, чем на плотной среде ЛЙ (p<0,05).

Таблица 2

Распределение результатов детекции роста МБТ в различных системах культивирования,

в том числе среди негативных по мазку образцов

____________

В+ — система BACTEC 960, положительный результат посева;

В- — система BACTEC 960, отрицательный результат посева;

L+ — плотная среда Левенштейна — Йенсена, положительный результат посева;

L- — плотная среда Левенштейна — Йенсена, отрицательный результат посева.

Из табл. 2 видно, что на двух средах одновременно рост МБТ дали 919 образцов (70%). Только в жидкой среде системы ВАСТЕС-960 культура МБТ была выделена в 22,2% образцов, исключительно на плотной среде ЛЙ удалось получить культуру в 5,5% случаев. Дополнительно детекция роста МБТ из негативных по мазку образцов показала, что, если на двух средах положительный результат посева удалось получить в 62,4% случаев, то использование системы ВАСТЕС MGIT 960 увеличило количество выделенных культур ещё на 26%. Однако выделенные 58 культур (8,7%) явились результатом культивирования только на плотной среде ЛЙ.

Таблица 3

Высеваемость МБТ в системе BACTEC MGIT — 960 и на плотных средах

Левенштейна — Йенсена по результатам микроскопии мазка диагностических образцов

______________

КУМ+ — результат микроскопии мазка положительный на наличие кислотоустойчивых микобактерий;

КУМ- — результат микроскопии мазка отрицательный на наличие кислотоустойчивых микобактерий.

Показательным стал сравнительный анализ высеваемости МБТ на двух исследуемых средах в зависимости от результата бактериоскопии мазка (табл.3). При оценке результативности культивирования образцы с положительным мазком показали рост культуры в системе ВАСТЕС MGIT 960 в 83,2, из негативных по мазку образцов высеваемость составила 23,6% случаев. На плотной среде ЛЙ рост культуры всех видов образцов был значительно ниже, чем на жидких средах: 67,1% из положительных по мазку образцов и 19,1% из бактериоскопически отрицательных образцов.

Таким образом, благодаря использованию автоматизированной системы ВАСТЕС-960 удавалось чаще выделять культуру МБТ по сравнению с плотными средами ЛЙ в среднем на 16% из положительных и на 4,5% из отрицательных по мазку образцов диагностического материала. На практике в количественном выражении эта разница в 4,5% при негативном мазке соответствовала 50 пациентам, у которых было подтверждено наличие бактериовыделения и диагностировано специфическое поражение органов дыхания, что указывало на неоспоримые преимущества автоматизированной системы ВАСТЕС MGIT 960 в диагностике туберкулеза.

При всех преимуществах бульонного культивирования в системе ВАСТЕС MGIT 960 осталась доля образцов, которые показали рост только традиционным методом посева на плотную питательную среду, в том числе в 8,7% случаев из негативных по мазку образцов. Таким образом, наиболее рациональным для практических лабораторий являлось параллельное выделение культуры в автоматизированной системе и на плотных яичных средах ЛЙ.

Период культивирования образцов в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960 по результатам испытания в бактериологической лаборатории РПТД был значительно короче, чем на плотных средах. Наибольшее число положительных находок среди посевов (86%) наблюдалось с 10-го по 20-й день после внесения диагностического материала в индикаторную пробирку, средняя длительность культивирования составила 14,7 дня. На плотной среде ЛЙ 91 % положительных результатов был получен с 28-го по 42-й день культивирования. В среднем сроки выявления МБТ из диагностического материала с применением автоматизированной систем ВАСТЕС MGIT 960 уменьшались в 2,6 раза.

Сроки тестирования лекарственной чувствительности в автоматизированной системе к препаратам первого ряда составили в среднем от 6 до 15 дней, т. е. в 3 — 4 раза меньше, чем методом абсолютных концентраций, при этом через 6 дней результат был получен у 12% изолятов, через 10 дней — у 39, на 13 — 15-й день — у 49%.

Для анализа результатов определения ЛЧ было использовано 953 культуры МБТ, выделенные от больных туберкулезом на жидких средах системы ВАСТЕС MGIT 960. Полученные данные были сравнены с результатами тестирования на чувствительность этих же образцов к препаратам первого ряда методом абсолютных концентраций на среде ЛЙ (табл.4). Наибольшая согласованность данных наблюдалась для изониазида, рифампицина и стрептомицина, наименьшая — для этамбутола. Отсутствие совпадений или расхождения результатов для указанных лекарственных препаратов прослеживались только в 0,75 — 1,5% случаев. Значительное расхождение традиционно имело место в отношении этамбутола (5%) в пользу большей чувствительности системы ВАСТЕС MGIT 960, что обусловлено техническими трудностями приготовления смеси этого лекарственного препарата для плотной среды.

Таблица 4

Результаты тестирования лекарственной чувствительности, полученные методом абсолютных концентраций на среде Левенштейна — Йенсена и в системе BACTEC-960

Выводы.Сравнение эффективности использования автоматизированной системы ВАСТЕС MGIT 960 для выявления и определения ЛЧ возбудителя туберкулеза с традиционными методами на плотных питательных средах показало более высокие диагностические возможности культивирования на жидких средах, что доказывает целесообразность её внедрения в лабораторную практику.

Автоматизированная система ВАСТЕС MGIT 960 сокращает сроки выделения МБТ из диагностического материала в среднем до 10-20 дней, уменьшает длительность определения ЛЧ МБТ до 6-15 дней.

Благодаря использованию жидких питательных сред в автоматизированной системе ВАСТЕС MGIT 960 повышается высеваемость МБТ как из бактериоскопически отрицательного, так и положительного по мазку диагностического материала.

Бактериологический анализатор ВАСТЕС MGIT 960 имеет специальный набор реактивов для тестирования лекарственной устойчивости МБТ к пиразинамиду, для которого не существует способа оценки чувствительности на плотных средах.

Оба метода демонстрируют согласованность в результатах выявления чувствительных и резистентных форм МБТ к основным ПТП.

Автоматизированная система ВАСТЕС MGIT 960 позволяет унифицировать культуральные исследования микробиологии.

Оптимальным решением для бактериологических лабораторий на практике является параллельное выделение культуры в автоматизированной системе и на плотных яичных средах Левенштейна − Йенсена.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Балабанова Я.М. и др.Использование автоматизированной системы ВАСТЕС MGIT 960 в диагностике лекарственной устойчивости к резервным препаратам в г. Самара// Туберкулез и болезни легких. 2009. №9.С.63-70.

2. Быкдарова К.Р. и др.Автоматизированная система ускоренной культуральной диагностики туберкулеза//Материалы VII Российского съезда фтизиатров. М., 2003. С.82

3. Диагностика и химиотерапия туберкулеза органов дыхания: Пособие для врачей. М.: Медицина и жизнь, 2003. 48с.

4. Иртуганова О.А. и др.Ускоренная культуральная диагностика туберкулеза с использованием автоматизированных систем ВАСТЕС MGIT 960 и МВ/ВАСТ//Пробл. туб. 2002. № 1. С. 58 — 62.

5. Иртуганова О. А. и др.Определение чувствительности Mycobacterium tuberculosis к пиразинамиду на бактериальном анализаторе ВАСТЕС 960 // Пробл. туб. 2003. № 7. С. 40 — 42.

6. Кондратюк Н.В.и др.Порiвняльна характеристика медикаментозноi чутливостi штамiв Mycobacterium tuberculosis // Мiкробiол. ж. 2006. Vol. 68, N 4. С. 54-59

7. Лабораторная диагностика туберкулеза / Под ред. В. И. Литвинова, А. М. Мороза. М.: МНПЦБТ, 2001. 184с.

8. Малахов В.Н. и др. Качество бактериологического выявления и определения лекарственной чувствительности микобактерий туберкулеза участниками федеральной системы внешней оценки качества клинических лабораторных исследований в 2002 — 2003 гг. //Пробл. туб. 2005. № 4. С. 6 — 10.

9. О совершенствовании противотуберкулезных мероприятий в Российской Федерации: Приказ МЗ РФ №109 от 21.03.2003.

10. Augustynowicz-Kopeć E.,Jaworski A.,Zwolska Z.Evaluation of Bactec MGIT 960 fluorescent method in diagnosis of tuberculosis//Pneumonol Alergol Pol.2002; 70(9-10):450-7.

11. Chien H.P. et al.Comparison of the BACTEC MGIT 960 with Lowenstein-Jensen medium for recovery of mycobacteria from clinical specimens. // Int. J. Tuberc. Lung Dis. 2000 9:866-870.

12. Laboratory Services in Tuberculosis Control. Geneva, WHO. 1998.

13. Lee J.J.et al.Comparative evaluation of the BACTEC MGIT 960 system with solid medium for isolation of mycobacteriа //