УДК 615.28

© Коллектив авторов, 2013

Поступила 09.09.2013 г.

С.В. КАРПОВ, А.В. ЕРЕМКИН,

Е.А. СОЛЕНОВА, С.И. ПАВЛОВА

СИНТЕЗ И ИССЛЕДОВАНИЕ АНТИМИКРОБНОЙ АКТИВНОСТИ РЯДА НОВЫХ ЦИАНОСОДЕРЖАЩИХ ПРОИЗВОДНЫХ НИКОТИНОВОЙ КИСЛОТЫ И ИМИДАЗОЛА

Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова, Чебоксары

Реализован синтез ряда новых, ранее неизвестных гетероциклических соединений, являющихся производными никотиновой кислоты и имидазола. Показано, что полученные соединения проявляют бактериостатический эффект по отношению к S. aureus, Streptococcus spp., E. coli, а также подавляют рост грибов рода Candida.

Ключевые слова: цианосодержащие гетероциклы, пиридин, имидазол, антимикробная активность.

Введение. Роль гетероциклических соединений в процессах жизнедеятельности растительных и животных организмов исключительно велика. К гетероциклическим соединениям относятся такие вещества, как хлорофилл растений, некоторые незаменимые аминокислоты, почти все алкалоиды, некоторые антибиотики, ряд витаминов, например, никотиновая кислота и её амид (витамин PP) и т.д. К соединениям этого класса принадлежат многие широко применяемые в медицине синтетические лекарственные вещества. Гетероциклические соединения также широко используют в различных отраслях промышленности (растворители, красители, ускорители вулканизации каучука и т.д.).

Следует отметить, что многие гетероциклические соединения обладают значительным синтетическим потенциалом. Разнообразие их структур обусловлено возможностью замены одного гетероатома на другой, а также возможностью направленного введения в их структуру требуемых функциональных групп.

Одними из наиболее удобных исходных соединений для синтеза азотсодержащих гетероциклов заданного строения являются 2-ацил-1,1,3,3-тетрацианопропениды 1 (АТЦП) и тетрацианоэтилен 3 (ТЦЭ), исследованием реакционной способности которых занимается наш коллектив в течение более чем десяти лет. Накопленный к настоящему времени объем теоретических и экспериментальных данных позволяет направленно вводить исходные полинитрилы в контролируемые каскадные трансформации, синтезируя в одну стадию требуемые гетероциклические системы с заданным функциональным обрамлением [1-3].

Помимо фундаментальной составляющей, практическая ценность этих исследований заключается в том, что многие из полученных гетероциклических систем могут обладать выраженной биологической активностью и в перспективе — найти разнообразное применение в качестве лекарственных средств [6].

Цель исследования. В ходе предварительных доклинических испытаний ряда производных АТЦП и ТЦЭ по отношению к условно-патогенным микроорганизмам нами было обнаружено, что многие из них обладают биоцидным действием в концентрациях, сравнимых с таковыми у некоторых серийно применяемых антибиотиков. Это является стимулом для дальнейших исследований в данной области, в т.ч. и направленной модификации полученных структур с целью получения более эффективных антимикробных соединений.

Материалы и методы. Исследуемые соединения представляют собой два структурных класса — N’-(4-ароил-6-хлоро-3,5-дицианопиридин-2-ил)-N,N-диметилформамиды 2 и 2-(3-амино-1,4-диазаспиро[4.5]дец-3-ен-2-илиден)малонодинитрил 4. Соединения 2 нами были синтезированы в условиях реакции Вильсмайера согласно схеме 1:

Схема 1

Выход продуктов 2 составил 67-78%. Бесцветные кристаллические вещества, плохо растворимые в воде. Растворимы в этаноле и диметилсульфоксиде (ДМСО).

2-(3-Амино-1,4-диазаспиро[4.5]дец-3-ен-2-илиден)малонодинитрил 4 был получен по трехкомпонентному «one-pot» методу при взаимодействии ТЦЭ, циклогексанона и ацетата аммония в среде тетрагидрофурана (схема 2).

Схема 2

Выход продуктов 4 составил 81%. Бесцветное кристаллическое вещество, плохо растворимое в воде. Растворимо в этаноле и ДМСО.

Контроль над ходом реакций и чистотой синтезированных веществ осуществлялся методом тонкослойной хроматографии на пластинках «Silufol UV-254», проявитель — УФ облучение, пары йода, термическое разложение. ИК-спектры снимали на приборе ИК-Фурье-спектрометре ФСМ-1202 в тонком слое (суспензия в вазелиновом масле). Спектры ЯМР 1Н регистрировали на спектрометре Bruker DRX-500, рабочая частота 500.13 МГц, растворитель — ДМСО-d6, внутренний стандарт — ТМС. Масс-спектры получены на приборе Finnigan МАТ.INCOS 50 (электронный удар 70 эВ).

Для первоначального скрининга антимикробной активности соединений 2 были взяты образцы 2а и 2в в концентрации 100 мкг/мл, исследование проводилось на культурах: Streptococcus spp., Staphylococcus aureus, Escherichia coli и грибах рода Candida методом лунок.

Метод лунок. Производился засев «газоном» поверхности стандартного мясо-пептонного агара суспензией исследуемых микроорганизмов. Далее поверхность агара подсушивалась и стерильным пробочным сверлом из агаровой пластины вырезали диски диаметром 10 мм, получая три симметрично расположенных отверстия. Диски извлекали стерильной иголкой из пластины, а в отверстия вносили по 100 мкл доз жидкости, содержащей исследуемый агент. После внесения жидкости в лунки чашки переносили в холодильник при 10 °С и спустя 10 часов переносили в термостат при температуре 28-37 °С (в зависимости от типа микроорганизма) на 1-4 суток. Измерялась зона подавления роста микроорганизмов, свидетельствующая о бактерицидных свойствах препарата.

Для первоначального скрининга антибактериальной активности соединений 4 был использован штамм S. a ureus J49 (ATCC 25923) с типичными морфологическими и биохимическими свойствами, полученный из коллекции музея живых культур ФГБУ ГИСК имени Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора. Его культивирование осуществлялось в питательном бульоне Brain-Heart Infusion (BHI; Gibco, США) во флаконах с аэрацией при 35°C. Для экспериментальных целей ночную культуру разводили так, чтобы концентрация в свежем BHI составила 107 микробных тел/мл, затем растили при 37°C до достижения средней log-фазы (время было установлено в предварительном эксперименте). Расчет концентрации микробных тел производили, измеряя оптическую плотность бактериальной суспензии (1 единица оптической плотности = 8,5·108 КОЕ/мл при длине волны 540 нм).

Использован метод серийных разведений в бульоне [4, 5]. Исследуемое вещество протестировано в двух сериях экспериментов, в каждом повторе опыта для него готовились 2 ряда разведений. В пробирки, содержащие по 0,5 мл соответствующего разведения тестируемого вещества в BHI или стерильном BHI (референтная проба), вносили по 0,5 мл инокулума стафилококка (106 КОЕ/мл) не позднее 30 мин с момента его приготовления так, чтобы конечная концентрация S. aureus составляла 5×105 КОЕ/мл. Опытные аэрируемые пробирки инкубировали в течение 24 ч в обычной атмосфере при 35°C, а пробирки c референтной пробой — при 4°C. Наличие роста определяли в проходящем свете, сравнивая опытные пробирки с референтной пробой. Минимальной подавляющей концентрацией (МПК) считали наименьшую концентрацию, которая приводила к видимому подавлению роста микроорганизма.

Результаты и их обсуждение. Результаты испытаний антимикробной активности соединений 2 представлены в таблице.

Уровни подавления роста микробов соединениями 2 методом лунок

Результаты испытаний антибактериальной активности методом разведений соединения 4 по отношению к S. aureus показали, что МПК 2-(3-Амино-1,4-диазаспиро[4.5]дец-3-ен-2-илиден)малонодинитрила составляет 32-64 мкг/мл. Поскольку МПК данного соединения достаточно высока, можно предположить, что синтезированное соединение обладает довольно умеренной антибактериальной активностью. Данные результаты могут быть связаны как с особенностями транспорта исследуемых соединений в бактериальную клетку микроорганизма, так и особенностями их фармакодинамики.

Таким образом, результаты исследования ряда полученных нами новых гетероциклических соединений по отношению к распространенным условно-патогенным микроорганизмам свидетельствуют о наличии у них рост-ингибирующего антимикробного эффекта. Несмотря на относительно высокие значения МПК, эти данные рассматриваются нами как базис для дальнейшей направленной модификации структур соединений 2 и 4 с привлечением методов медицинской химии, таких как докинг и 3D QSAR.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. 2-Ацил(ароил)-1,1,3,3-тетрацианопропениды I. Синтез 2-[5-амино-2-арил-2-хлор-4-цианофуран-3(2H)-илиден]малононитрилов взаимодействием 2-ароил-1,1,3,3-тетрацианопропенидов калия с концентрированной соляной кислотой / С.В. Карпов [и др.] // Журн. орг. хим. — 2011. — Т. 47, №3. — С. 412-414.

2. 2-Ацил(ароил)-1,1,3,3-тетрацианопропениды II. Синтез 2-(5-амино-4-циано-2-арил-2-(алкилтио)фуран-3(2H)-илиден)малононитрилов взаимодействием с тиолами / С.В. Карпов [и др.] // Журн. орг. хим. — 2011. — Т. 47, №8. — С. 1144-1146.

3. 2-Ацил(ароил)-1,1,3,3-тетрацианопропениды III. Реакции гетероциклизации под действием галогеноводородов / С.В. Карпов [и др.] // Журн. орг. хим. — 2011. — Т. 47, №10. — С. 1467-1172.

4. Методические рекомендации по доклиническому изучению противомикробной активности лекарственных средств / Т.А. Гуськова [и др.] // Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Ч.1. — М.: Гриф и К, 2012. — С. 509 — 520.

5. Определение чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам: метод. указания. — М.: Федеральный центр госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004. — 91 с.

6. Garuti L. Nitrogen-containing heterocyclic quinones: a class of potential selective antitumor agents / L. Garuti, M. Roberti, D. Pizzirani // Mini Rev. Med. Chem. — 2007. — Vol. 7, № 5. — P. 481-489.

СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ:

Карпов Сергей Владимирович

ассистент кафедры органической и фармацевтической химии ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова», кандидат химических наук

Еремкин Алексей Владимирович

доцент кафедры органической и фармацевтической химии ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова», кандидат химических наук

Соленова Елена Александровна

студентка медицинского факультета ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова»

Павлова Светлана Ивановна

заведующая кафедрой фармакологии, клинической фармакологии и биохимии ФГБОУ ВПО «Чувашский государственный университет им. И.Н. Ульянова», доктор медицинских наук

Адрес для переписки:

428015, Чебоксары, Московский пр., 15

Тел.: +7 (8352) 45-24-68 (доб. 2301)

E-mail: serg31.chem@mail.ru.

INFORMATION ABOUT THE AUTHORS:

Sergey Vladimirovich Karpov

assistant of Organic and Pharmaceutical Chemistry department at FSBEI HPE «the Chuvash State University named after I.N. Ulyanov», Ph.D. of Chemistry

Aleksey Vladimirovich Eremkin

associate professor of Organic and Pharmaceutical Chemistry department at FSBEI HPE «the Chuvash State University named after I.N. Ulyanov», Ph.D. of Chemistry

Elena Alexandrovna Solenova

student of Medical faculty of FSBEI HPE «the Chuvash State University named after I.N. Ulyanov»

Svetlana Ivanovna Pavlova

head of Pharmacology, Clinical Pharmacology and Biochemistry department of FSBEI HPE «the Chuvash State University named after I.N. Ulyanov», Doctor of Medicine

Correspondence address:

Moskovskу av., 15, Cheboksary, the Chuvash Republic, 428015

Tel.: +7 (8352) 45-24-68

E-mail: serg31.chem@mail.ru.

S.V. KARPOV, A.V. EREMKIN,

E.A. SOLENOVA, S.I. PAVLOVA

SYNTHESIS AND ANALYSIS OF ANTIMICROBIAL ACTIVITY

OF SOME CYANO-CONTAINING DERIVATIVES

OF NICOTINIC ACID AND IMIDAZOLE

The Chuvash State University named after I.N. Ulyanov , Cheboksary

The article informs about synthesis of some new, previously unknown heterocyclic compounds, which are the derivatives of nicotinic acid and imidazol. It was shown that these compounds tend to have bacteriostatic effect towards S. aureus, Streptococcus spp., E. coli, and also inhibit growth of Candida.

Key words: cyano-containing heterocycles, pyridine, imidazol, antimicrobial activity.